बाजार में सामान्य ग्लास-बॉटम पेट्री डिश के लिए, आमतौर पर प्लास्टिक पेट्री डिश के तल में एक छेद बनाया जाता है, और फिर एक कवर ग्लास या सेल स्लाइड को 170-220 माइक्रोन की मोटाई के साथ चिपकाया जाता है। छाया रहित गोंद या सिलिका जेल के साथ पेट्री डिश। पेट्री डिश का पूरा तल कांच का नहीं होता है। अवलोकन के लिए उपयुक्त क्षेत्र केवल वेध के क्षेत्र में है। हालांकि, कांच की हाइड्रोफोबिसिटी के कारण, कोशिकाओं को संवर्धन करते समय, कोशिकाएं कांच का अच्छी तरह से पालन नहीं कर सकती हैं, और विकास की स्थिति अच्छी नहीं है, और यहां तक कि सेल प्रदूषण की घटना भी कॉन्फोकल स्कैनिंग इमेजिंग के दौरान होती है।
कोशिकाओं को अच्छी तरह से पालन करने के लिए, यह पुष्टि करना आवश्यक है कि सेल संस्कृति के लिए ग्लास बॉटम डिश का उपयोग करने से पहले विशिष्ट प्रोटीन अभिकर्मकों को लेपित किया गया है।
डू-इट-योरसेल्फ रजाई
विभिन्न सेल संस्कृतियों के लिए अलग-अलग कोटिंग अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है। एक ही समय में, क्योंकि कोटिंग के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला प्रोटीन एक जैविक उत्पाद है, विभिन्न कंपनियों के कोटिंग प्रोटीन की उत्पाद शुद्धता और खुराक अलग-अलग होती है। यह तकनीकी पद केवल संदर्भ के लिए है। कोटिंग अभिकर्मकों के विशिष्ट खुराक को इस्तेमाल किए गए ब्रांडों के निर्देशों का उल्लेख करना चाहिए। . और सबसे उपयुक्त कोटिंग एकाग्रता खोजने के लिए आपके द्वारा उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों के साथ एक ढाल प्रयोग करना सबसे अच्छा है।
यहाँ पॉली-एल-लाइसिन (PLL, सिग्मा, P4832, 100ug/ml) का एक उदाहरण दिया गया है:
पीएलएल कोटिंग अधिकांश कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है, विशेष रूप से केंद्रीय प्रणाली में न्यूरॉन्स की संस्कृति के लिए। उपयोग के दौरान वांछित मात्रा तक पहुंचने के लिए प्रति इकाई क्षेत्र में प्रोटीन सामग्री (ug/cm2) बनाना आवश्यक है। इस उदाहरण में PLL के लिए कोटिंग की अनुशंसित मात्रा 2 ug/cm2 है। कोटिंग क्षेत्र और कोटिंग मात्रा के अनुसार आवश्यक प्रोटीन की मात्रा की गणना करना आवश्यक है।
उदाहरण के लिए: 35mm ग्लास बॉटम पेट्री डिश, सेल ग्रोथ एरिया 3.5cm2 है, कोटिंग एरिया 4.1cm2 है, और कोटिंग सॉल्यूशन का वॉल्यूम 400ul है, तो अनुशंसित खुराक 2ug/cm2 है। फिर एक कुएं में 8.2 ug PLL की जरूरत होती है। यदि PLL घोल का केवल 400 ul मिलाया जाता है, तो PLL घोल की सांद्रता 20.5 ug/ml (लगभग 20 ug/ml) होती है। इसलिए, स्टॉक सॉल्यूशन को अल्ट्राप्योर पानी से पतला करने की जरूरत है।
विशिष्ट चरण:
1. पीएलएल स्टॉक सॉल्यूशन 1:5 को अल्ट्राप्योर पानी से पतला करें।
2. प्रत्येक 35 मिमी ग्लास बॉटम पेट्री डिश में 400 उल पीएलएल कमजोर पड़ने को जोड़ें।
3. कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें और पीएलएल कमजोर पड़ने की आकांक्षा करें।
4. पीबीएस समाधान या सीरम मुक्त माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ 3 बार सावधानी से धोएं, और धोने के समाधान की आकांक्षा करें।
5. सीधे खेती के लिए सेल निलंबन जोड़ें।
विधि मूल्यांकन
विभिन्न कोटिंग प्रोटीन के विभिन्न गुणों के कारण, विभिन्न कोटिंग प्रोटीन का उपयोग अलग-अलग तरीकों से किया जाता है। ग्लास बॉटम डिशेज को कोट करने की आवश्यकता के कारण अक्सर नया संदूषण पैदा होता है। इसके अलावा, संदूषण अक्सर कोशिकाओं के उठने के बाद खोजा जाता है, जो न केवल समय में देरी करता है, बल्कि किट उपभोग्य सामग्रियों को भी बर्बाद करता है। आखिरकार, लेपित प्रोटीन अभिकर्मकों और गुणवत्ता-आश्वासन वाले ग्लास-बॉटम व्यंजन महंगे हैं (खराब गुणवत्ता वाले ग्लास-बॉटम व्यंजन लीक हो सकते हैं क्योंकि गोंद चिपचिपा नहीं है या इस्तेमाल किया गया गोंद कोशिकाओं के लिए विषाक्त है)।
कॉन्फोकल पेट्री डिश बिना कोटिंग के
जो बच्चे समय और मेहनत बचाना चाहते हैं, उनके लिए बिना कोटिंग के कॉन्फोकल कल्चर व्यंजन का उपयोग करना अधिक सुविधाजनक है।
एक उपयुक्त कल्चर डिश का चयन करते समय विचार करने वाले कारक हैं: क्या यह आपकी अपनी कोशिकाओं के पालन के लिए उपयुक्त है, क्या कल्चर डिश की ऑप्टिकल विशेषताएं कॉन्फोकल आवश्यकताओं को पूरा करती हैं।
उपरोक्त कारकों की आवश्यकताओं को पूरा करने वाले पेट्री डिश कोटेड ग्लास बॉटम डिश तक सीमित नहीं हैं। वास्तव में, हर कोई जानता है कि कांच की तुलना में प्लास्टिक के व्यंजन सस्ते और कोशिकाओं के लिए आसान होते हैं। यहाँ शंघाई जिंगान से एक कॉन्फोकल कल्चर डिश का एक उदाहरण दिया गया है, उन मापदंडों के बारे में बात करने के लिए जो कॉन्फोकल प्रयोगों के लिए उपयुक्त एक कल्चर डिश की आवश्यकता है:
यह देखा जा सकता है कि प्रत्यक्ष उपयोग की आवश्यकताओं को पूरा करने वाले कॉन्फोकल कल्चर व्यंजनों के भौतिक पैरामीटर ग्लास के बहुत करीब हैं, लेकिन साथ ही, उनके पास हाइड्रोफिलिक गुण भी होते हैं, जो अधिकांश कोशिकाओं को बेहतर बना सकते हैं; और लचीलापन कांच से बेहतर है। यह अधिकांश सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं को सीधे दीवार का पालन करने की अनुमति देता है, और यह नाजुक नहीं है, जो एक अच्छा विकल्प है।
आप अपनी विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और उपरोक्त तालिका में मापदंडों के अनुसार अपने प्रयोग के लिए सबसे उपयुक्त कॉन्फोकल कल्चर डिश भी पा सकते हैं।
विधि मूल्यांकन
इस प्रकार के पेट्री डिश को चुनने के लिए अतिरिक्त कोटिंग की आवश्यकता नहीं होती है, जिससे संदूषण का खतरा बहुत कम हो जाता है। और चूंकि प्लास्टिक के तल के साथ काम करना आसान है, पेट्री डिश के तल पर इसे ठीक करने के लिए किसी गोंद की आवश्यकता नहीं है। रिसाव या साइटोटोक्सिसिटी की संभावना को खत्म करें।