सेल कल्चर क्या है?
कोश पालन
सेल कल्चर से तात्पर्य उनके प्राकृतिक वातावरण के बाहर नियंत्रित परिस्थितियों में कोशिकाओं के बढ़ने की प्रक्रिया से है। यह एक इन विट्रो उपकरण है जो कोशिका जीव विज्ञान और रोग तंत्र को समझने की सुविधा प्रदान करता है। यह दवा की खोज में भी भूमिका निभाता है, जैसे दवा विषाक्तता परीक्षण और फार्माकोकाइनेटिक/फार्माकोडीनेमिक अध्ययन, साथ ही व्यक्तिगत दवा।
अमेरिकी भ्रूणविज्ञानी रॉस ग्रानविले हैरिसन ने 20वीं सदी की शुरुआत में इन विट्रो सेल कल्चर तकनीक में पहली बार विकसित किया, जब उन्होंने इन विट्रो में मेंढक भ्रूण से ऊतक के टुकड़ों को सफलतापूर्वक विकसित किया। आज, सेल कल्चर ने अनगिनत खोजों में मदद की है, जैसे कि पोलियो, खसरा, कण्ठमाला और अन्य संक्रामक रोगों के खिलाफ टीकों का विकास।
आसंजन और निलंबन संस्कृति
सेल के विकास के लिए दो बुनियादी प्रणालियाँ हैं: अनुयाई संस्कृति और निलंबन संस्कृति। अनुवर्ती संस्कृतियों को कृत्रिम सब्सट्रेट्स पर उगाया जाता है, जबकि निलंबन संस्कृतियों में कोशिकाएं माध्यम में स्वतंत्र रूप से तैरती हैं। जबकि निलंबन में केवल कुछ प्रकार की कोशिकाएँ स्वाभाविक रूप से बढ़ती हैं (जैसे लिम्फोसाइट्स), कई अनुयाई कोशिका प्रकारों को निलंबन संस्कृति के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
निलंबन में स्वाभाविक रूप से अनुयाई कोशिकाओं के संवर्धन के दो कारण हैं। सस्पेंशन कल्चर का पहला फायदा यह है कि कोशिकाओं को पारित करना आसान होता है क्योंकि आपको उन्हें कल्चर पोत से एंजाइमेटिक या यांत्रिक रूप से अलग करने की आवश्यकता नहीं होती है। दूसरा, निलंबन संस्कृतियों को बढ़ाना आसान होता है क्योंकि सेल की वृद्धि केवल माध्यम में उनकी एकाग्रता से सीमित होती है, उपलब्ध सतह क्षेत्र द्वारा नहीं। निलंबन संस्कृतियों का मुख्य नुकसान यह है कि उन्हें विकास पैटर्न का पालन करने के लिए दैनिक सेल काउंट और व्यवहार्यता परख की आवश्यकता होती है, जबकि एक माइक्रोस्कोप के तहत पालन संस्कृतियों की आसानी से जांच की जा सकती है।
2डी और 3डी तरीके
अनुयायी संस्कृतियों को आगे 2डी और 3डी संस्कृतियों में विभाजित किया जा सकता है। 2डी अनुप्रयोगों में, अनुयाई कोशिकाओं को एक समतल सतह पर एक मोनोलेयर सिस्टम में उगाया जाता है, जैसे कि सेल कल्चर फ्लास्क में।
कोश पालन
इसकी सादगी के कारण, 2डी तकनीक कोशिकाओं के विवो वातावरण की नकल नहीं कर सकती है, जो आमतौर पर जटिल सेल-टू-सेल इंटरैक्शन के साथ त्रि-आयामी संरचनाओं में विकसित होती हैं। यही कारण है कि 3डी संस्कृतियों का उपयोग करके कुछ प्रयोग किए जाते हैं जिन्हें स्कैफोल्ड-आधारित या मचान-मुक्त तकनीकों का उपयोग करके उगाया जा सकता है।
मचान-आधारित 3डी विधियों में आमतौर पर हाइड्रोजेल मचान में अनुयाई कोशिकाओं को बढ़ाना शामिल होता है। कुछ अनुप्रयोगों के लिए जैव-सिरेमिक, धातु या बहुलक मचान जैसे विकल्प भी उपयोग किए जाते हैं।
मचान-मुक्त तकनीकों का उपयोग तीन अलग-अलग तरीकों में से एक द्वारा गोलभों को विकसित करने के लिए किया जाता है:
जबरन फ्लोट: सेल निलंबन को कम पालन वाले बहुलक-लेपित माइक्रोप्लेट के कुओं में लोड करें। माइक्रोप्लेट को तब कोशिकाओं को गोलाकार बनाने के लिए मजबूर करने के लिए सेंट्रीफ्यूज किया जाता है।
हैंगिंग ड्रॉप: सेल सस्पेंशन को हैंगिंग ड्रॉप प्लेट के कुओं में लोड किया जाता है। जैसा कि नाम से पता चलता है, निलंबन प्लेट पर बूंदों के रूप में लटका रहेगा। कोशिकाएं इन बूंदों के सिरों पर एकत्र होंगी और गोलाकार बनेंगी।
आंदोलन-आधारित: सेल निलंबन को घूर्णन बायोरिएक्टर में रखा गया है। निरंतर आंदोलन के कारण, कोशिकाएं दीवारों का पालन करने में असमर्थ थीं, इस प्रकार स्फेरोइड्स का निर्माण हुआ।
सेल कल्चर चैलेंज
तरीकों और तकनीकों में अंतर के बावजूद, सभी प्रयोगों में एक बात समान है: प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक संख्या में जीवित कोशिकाओं को विकसित करना मुश्किल है। इसलिए, निम्नलिखित खंड चार चुनौतियों के लिए समर्पित होंगे - दोहराव, संदूषण, व्यवहार्यता और स्वचालन के लिए संक्रमण।
reproducibility
योंग्यू मेडिकल के एक सर्वेक्षण के अनुसार, 70 प्रतिशत से अधिक वैज्ञानिकों ने बताया कि वे किसी अन्य वैज्ञानिक के प्रयोगों को पुन: उत्पन्न करने में विफल रहे, और आधे से अधिक अपने स्वयं के कार्य को पुन: उत्पन्न करने में विफल रहे। सेल कल्चर परख में, अधिकांश पुनरुत्पादन समस्याएं सेल मार्ग या पीढ़ियों के बीच जैविक अंतर से उत्पन्न होती हैं। एक और बड़ी समस्या सेल लाइनों की गलत पहचान है, और संस्कृति के मापदंडों में विसंगतियां भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं।
जैविक भिन्नता
रैंडम म्यूटेशन या ट्रांसक्रिप्शन त्रुटियों जैसे कारकों में सेल के विभाजित होने पर हर बार प्रयोगों की पुनरुत्पादन क्षमता को प्रभावित करने की क्षमता होती है। इससे बचने के लिए आपको किसी नए प्रोजेक्ट की शुरुआत में एक सेल बैंक बनाना चाहिए।
सेल बैंक
सेल बैंकिंग बाद में उपयोग के लिए विशिष्ट सेल प्रकारों के बैचों को संग्रहीत करने की प्रक्रिया को संदर्भित करता है, जैसे कि यादृच्छिक म्यूटेशन या ट्रांसक्रिप्शन त्रुटियों से बचने के लिए जो पुनरुत्पादन को प्रभावित करते हैं। पहला कदम संस्कृति में चयनित सेल प्रकार की रुचि को बढ़ाकर और उन्हें कई कंटेनरों में क्रायोप्रेज़र्व करके एक मास्टर सेल बैंक (एमबीसी) स्थापित करना है। एमबीसी बैचों को पिघलाया जाता है और बाद में कार्यशील सेल बैंक (डब्ल्यूबीसी) तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है।
सेल लाइनों की गलत पहचान
सेल लाइन की गलत पहचान की समस्या 1960 के दशक से ज्ञात है, जब एक वैज्ञानिक ने 19 अन्य मानव सेल लाइनों के हेला सेल संदूषण का वर्णन किया था। यह सुनिश्चित करने के लिए कि आपके परिणाम विश्वसनीय हैं और इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि आप गलत निष्कर्ष नहीं निकालते हैं, आपको प्रयोगशाला में प्रवेश करने वाली सभी नई सेल लाइनों को तब तक क्वारंटाइन करना चाहिए जब तक कि उनकी उत्पत्ति सत्यापित नहीं हो जाती। सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि क्रायोप्रिजर्वेशन और अन्य प्रयोगशालाओं में वितरण से पहले और परियोजना पूरी होने के बाद सेल लाइन योग्यता को दोहराने की सिफारिश की जाती है। सेल लाइन को सत्यापित करने के लिए, आपको पहले यह जांचना चाहिए कि यह गलत पहचान वाली सेल लाइन रजिस्ट्री में सूचीबद्ध है या नहीं। यदि यह पंजीकृत नहीं है, तो भी आपको इसकी प्रामाणिकता की पुष्टि करने की आवश्यकता है। मानव कोशिका रेखाओं के लिए, शॉर्ट टैंडेम रिपीट (एसटीआर) विश्लेषण (डीएनए फिंगरप्रिंटिंग) की सिफारिश की जाती है। गैर-मानव सेल लाइनों के लिए विभिन्न प्रकार की परीक्षण विधियाँ उपलब्ध हैं, जिनमें कैरियोटाइपिंग, आइसोएंजाइम विश्लेषण और माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए टाइपिंग (डीएनए बारकोडिंग) शामिल हैं।
संस्कृति पैरामीटर
पुनरुत्पादन को प्रभावित करने वाला तीसरा कारक संस्कृति पैरामीटर है।
उदाहरण के लिए, ऑक्सीजन का स्तर सुसंस्कृत कोशिकाओं को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकता है। हालाँकि, चर जो ऑक्सीजन को प्रभावित करते हैं, जैसे कि कक्ष आकार या सेल घनत्व, हमेशा प्रलेखित नहीं होते हैं और इसलिए उन्हें सुसंगत नहीं रखा जा सकता है।
एक अन्य महत्वपूर्ण संस्कृति पैरामीटर माध्यम है। यह आवश्यक पोषक तत्व, विकास कारक और हार्मोन प्रदान करता है, और पीएच और आसमाटिक दबाव को नियंत्रित करता है। इसलिए, सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि इसकी रचना हमेशा समान होती है। यह विशेष रूप से भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक मध्यम योगों के लिए महत्वपूर्ण है, जिसकी संरचना गाय के आहार, भौगोलिक स्थिति और वर्ष के समय जैसे कारकों पर निर्भर करती है। परिणामों की पुनरुत्पादन क्षमता पर FBS के प्रभाव को कम करने के लिए, आपको सीरम के विभिन्न बैचों का ऑर्डर देना चाहिए जब मौजूदा स्टॉक कम होने लगें और निकटतम मिलान खोजने के लिए उनका परीक्षण करें। दूसरों के लिए आपके परिणामों को पुन: प्रस्तुत करने के लिए, आपको रिपोर्ट करनी चाहिए कि आपने सीरम की जांच कैसे की और लॉट नंबर रिकॉर्ड करें।
कोश पालन
सेल प्रसंस्करण
अधिकांश शोधकर्ता जानते हैं कि संस्कृति के मापदंडों का उनके अनुप्रयोगों पर बहुत बड़ा प्रभाव पड़ता है, लेकिन प्रसंस्करण तकनीकों में बदलाव की अक्सर अनदेखी की जाती है।
प्रदूषण
जब कोशिकाओं को ऊतक से अलग किया जाता है और प्रयोगशाला में विकसित किया जाता है, तो वे अब प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा संरक्षित नहीं होती हैं और इसलिए संदूषण के प्रति बेहद संवेदनशील होती हैं।
संदूषण का पहला स्रोत अजैविक संदूषक हैं जैसे संस्कृति माध्यम, सीरम, पूरक या पानी में अशुद्धियाँ, साथ ही एंडोटॉक्सिन और लीचेबल। सावधानियों में सेल कल्चर प्रयोगों के लिए प्रयोगशाला-ग्रेड पानी का उपयोग, और एंडोटॉक्सिन परीक्षण प्रमाणन प्रदान करने वाले निर्माताओं से मीडिया, सीरम, पूरक और उपभोग्य वस्तुएं शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, प्लास्टिक एडिटिव्स आपके सेल कल्चर में रिसने न पाए, यह सुनिश्चित करने के लिए उपभोग्य सामग्रियों को वर्जिन पॉलीस्टाइनिन या पॉलीप्रोपाइलीन से बनाया जाना चाहिए।
संदूषण का दूसरा स्रोत जैविक संदूषक हैं जैसे बैक्टीरिया (माइकोप्लाज्मा सहित), कवक और खमीर।
व्यवहार्यता
सेल व्यवहार्यता को एक नमूने में व्यवहार्य कोशिकाओं के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया है। हमने अभी-अभी जो संदूषकों को देखा है, उसके अलावा कई अन्य कारक भी हैं जो सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करते हैं। पर्यावरण की स्थिति - तापमान, पीएच, आसमाटिक दबाव, पोषक तत्वों की उपलब्धता और O2 और CO2 सांद्रता - बहुत महत्वपूर्ण हैं। इनमें से अधिकांश चर माध्यम द्वारा नियंत्रित होते हैं और सेल प्रकार विशिष्ट होते हैं, जिसका दुर्भाग्य से अर्थ है कि हम विशिष्ट दिशानिर्देश प्रदान नहीं कर सकते हैं।
चूंकि कोशिकाएं दबाव के प्रति बहुत संवेदनशील होती हैं, इसलिए आपको न केवल पर्यावरणीय परिस्थितियों पर ध्यान देना चाहिए, बल्कि अपनी तरल से निपटने की तकनीक पर भी ध्यान देना चाहिए।
सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करने वाला एक अंतिम कारक जीर्णता है। अधिकांश परिमित कोशिका रेखाएं मरने से पहले 20 से 60 विभाजनों तक जीवित रहती हैं, जिसका अर्थ है कि उनका केवल 15 से 45 पीढ़ियों के बीच पुन: उपयोग किया जा सकता है। बाद में, क्रायोसंरक्षित नमूने को सेल बैंक से गल जाने की आवश्यकता है। निरंतर कोशिका रेखाएँ अनिश्चित काल तक फैल सकती हैं, लेकिन क्योंकि वे आनुवंशिक बहाव से ग्रस्त हैं, उन्हें नियमित रूप से बदला जाना चाहिए।
सेल व्यवहार्यता को मापने के लिए वर्णमिति, फ्लोरोमेट्रिक और बायोल्यूमिनेसेंट विधियों का उपयोग करके जांच परख का उपयोग किया जा सकता है। आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली वर्णमिति विधि MTT विधि है, जो जीवित कोशिकाओं द्वारा पीले टेट्राजोलियम लवणों को बैंगनी फॉर्मेज़न क्रिस्टल में कम करने पर आधारित है।
96-वेल प्लेटें
स्वचालन
ऊपर वर्णित कई चुनौतियों को सेल कल्चर वर्कफ्लो को स्वचालित करके संबोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, सेल हैंडलिंग हमेशा सुसंगत रहेगी, प्रजनन क्षमता और व्यवहार्यता पर सकारात्मक प्रभाव डालती है। सबसे महत्वपूर्ण बात, स्वचालन उपयोगकर्ता संदूषण के जोखिम को कम करता है।
इन फायदों के बावजूद, बजट कारणों, रोबोटों के लिए जगह की कमी, या प्रत्येक चरण को एक बार में स्वचालित और मान्य करने के लिए पर्याप्त संसाधन नहीं होने के कारण पूरे वर्कफ़्लोज़ को स्वचालित करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है। लेकिन इसे सुलझाया जा सकता है!