1. सेल रिकवरी
क्रायोसंरक्षित कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन से हटा दिए जाने के बाद, उन्हें 37 डिग्री पानी के स्नान में लगातार झटकों के साथ पिघलाया गया। पिघला हुआ कोशिकाओं को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें, 37 डिग्री (जिसमें से भ्रूण गोजातीय सीरम लगभग 10 प्रतिशत है) पर पूर्व-गर्म डीएमईएम पूर्ण माध्यम जोड़ें, धीरे-धीरे समान रूप से उड़ाएं, 2 मिनट के लिए 500 ग्राम पर अपकेंद्रित्र, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
सुपरनेटेंट को धोने और त्यागने के लिए डीएमईएम पूरा माध्यम जोड़ें। डीएमईएम पूर्ण माध्यम जोड़ें, पिपेटिंग द्वारा धीरे-धीरे मिश्रण करें, एक सेल निलंबन बनाएं, इसे पेट्री डिश/फ्लास्क में डालें, और 5 प्रतिशत सीओ युक्त सेल इनक्यूबेटर में संस्कृति करें।
2. कोशिका मार्ग
जब सेल घनत्व 80 प्रतिशत ~ 90 प्रतिशत तक पहुंच जाता है (समय से पहले उपज अपर्याप्त है, बहुत देर से कोशिकाएं खराब स्थिति में हैं, 1: 2 से 1:10 या उससे अधिक के अनुपात में उपसंस्कृति, आम तौर पर 1: 3 से 1: 5 सेल पीढ़ी, अर्थात्, सेल इनोक्यूलेशन से जुदाई और पुन: खेती के समय, पूरा माध्यम हटा दिया गया था और 1X पीबीएस के साथ दो बार धोया गया था।
ट्रिप्सिन जोड़ें (ध्यान दें: पाचन समाधान की मात्रा कोशिकाओं को कवर करने के लिए सबसे अच्छी है, और इष्टतम पाचन तापमान 37 डिग्री है। एक माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें: एक उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत पचे हुए कोशिकाओं का निरीक्षण करें, यदि साइटोप्लाज्म वापस ले लिया जाता है, तो कोशिकाएं अब एक साथ जुड़े नहीं हैं। स्लाइस, यह दर्शाता है कि कोशिकाएं इस समय ठीक से पच जाती हैं), उन्हें डाइजेस्ट करें, और उन्हें सेल इनक्यूबेटर में लगभग 2-3 मिनट के लिए रखें।
ट्रिप्सिनाइजेशन को रोकने के लिए डीएमईएम पूर्ण माध्यम की उचित मात्रा जोड़ें, 2 मिन के लिए 500 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज में ट्रांसफर करें, सुपरनेटेंट को त्यागें, धोने के लिए डीएमईएम पूरा माध्यम जोड़ें और सुपरनेटेंट को त्याग दें।
डीएमईएम पूर्ण माध्यम जोड़ें, धीरे-धीरे पिपेटिंग द्वारा मिश्रण करें, गिनती के लिए 10 माइक्रोलिटर पिपेट करें, और फिर आवश्यक सेल वॉल्यूम के अनुसार 5 प्रतिशत सीओ 2 युक्त सेल इनक्यूबेटर में संस्कृति जारी रखें।
3. सेल क्रायोप्रिजर्वेशन
जब सेल घनत्व 80 प्रतिशत ~ 90 प्रतिशत तक पहुंच जाता है, तो पूरा माध्यम हटा दें और 1X पीबीएस के साथ 2 बार धो लें। पाचन के लिए ट्रिप्सिन जोड़ें और लगभग 2-3 मिनट के लिए सेल इनक्यूबेटर में रखें। ट्रिप्सिन पाचन को रोकने के लिए डीएमईएम पूरा माध्यम जोड़ें, एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और 2 मिनट के लिए 500 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, सुपरनेटेंट को त्यागें, धोने के लिए डीएमईएम पूरा माध्यम जोड़ें, और सुपरनेटेंट को त्याग दें। 1 मिली फ्रीजिंग सॉल्यूशन (90 प्रतिशत भ्रूण गोजातीय सीरम, 10 प्रतिशत डीएमएसओ) जोड़ें। सामान्यतया, सीरम सामग्री को 10 प्रतिशत और 90 प्रतिशत के बीच समायोजित किया जा सकता है। फ्रीजिंग सॉल्यूशन में सीरम जोड़ने से एक ओर कोशिकाओं को पोषक तत्व मिल सकते हैं, और कर सकते हैं सेल क्रायोप्रेज़र्वेशन के दौरान गैर-पारगम्य सुरक्षात्मक पदार्थ प्रदान करें, जैसे कि सुक्रोज़, एल्ब्यूमिन, आदि कोशिकाओं की बेहतर सुरक्षा के लिए), इसे क्रायोप्रिज़र्वेशन ट्यूब में डालें (तापमान में कमी की गति सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब में आइसोप्रोपिल अल्कोहल होता है), इसे तुरंत डालें 30 मिनट के लिए 4 डिग्री रेफ्रिजरेटर में फ्रीज करें, फिर 30 मिनट के लिए -20 डिग्री रेफ्रिजरेटर में रखें, और फिर रात भर -80 डिग्री रेफ्रिजरेटर में रखें।
इसे अगले दिन लिक्विड नाइट्रोजन में डाल दें, इसे कम से कम दो साल तक स्टोर किया जा सकता है, और अगर आप इसे लिक्विड नाइट्रोजन में नहीं डालते हैं, तो इसे तीन महीने तक स्टोर किया जा सकता है।
सेल क्रायोप्रेज़र्वेशन और रिकवरी का सिद्धांत है: धीमी ठंड और विगलन, जो सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए अधिक अनुकूल है। किसी भी सुरक्षात्मक एजेंट के बिना कोशिकाओं के क्रायोप्रिजर्वेशन से इंट्रासेल्युलर आइस क्रिस्टल का उत्पादन होगा, जो कोशिकाओं को अंतर्जात यांत्रिक क्षति का कारण बनेगा, इंट्रासेल्युलर वातावरण आसमाटिक दबाव, पीएच, इलेक्ट्रोलाइट्स आदि में परिवर्तन का कारण बनेगा और फिर कोशिका मृत्यु को बढ़ावा देगा।
4. मामलों पर ध्यान देने की जरूरत है
(1) कल्चर सॉल्यूशन को प्रीहीट करना: कल्चर सॉल्यूशन, पीबीएस और ट्रिप्सिन युक्त तैयार बोतल को पहले से गरम करने के लिए 37 डिग्री पानी के स्नान में डालें;
(2) अल्ट्रा-क्लीन वर्कबेंच और उन हाथों को पोंछने के लिए 75 प्रतिशत अल्कोहल का उपयोग करें जिन्हें पराबैंगनी किरणों से विकिरणित किया गया है;
(3) प्रयुक्त उपकरणों का सही स्थान: पर्याप्त संचालन स्थान सुनिश्चित करें, जो न केवल संचालित करना आसान है बल्कि प्रदूषण को भी कम करता है;
(4) शराब का दीपक जलाएं: ध्यान दें कि लौ बहुत छोटी नहीं होनी चाहिए;
(5) सख्त सड़न रोकनेवाला ऑपरेशन;
(6) संलग्न कोशिकाओं का मध्यम पाचन: पाचन का समय कई कारकों से प्रभावित होता है जैसे कि पाचन समाधान का प्रकार, तैयारी का समय और संस्कृति फ्लास्क में डाली गई मात्रा। पाचन प्रक्रिया के दौरान सुसंस्कृत कोशिकाओं के आकार में होने वाले परिवर्तनों पर ध्यान देना चाहिए। एक बार जब साइटोप्लाज्म सिकुड़ जाता है, यदि कनेक्शन ढीला हो जाता है, या टुकड़ों में तैरने के संकेत मिलते हैं, तो पाचन तुरंत समाप्त हो जाना चाहिए;
(7) निष्क्रिय कोशिकाओं पर सभी प्रचालन एल्कोहल लैम्प की लौ के यथासंभव निकट होने चाहिए। प्रत्येक सेल के लिए उपकरण के एक सेट का उपयोग करके, एक समय में केवल एक सेल के साथ काम करना सबसे अच्छा है। क्रॉस संक्रमण से बचें;
(8) हर बार खोले या बंद किए जाने पर पारित सेल के बोतल मुंह को शराब के दीपक पर निर्जलित करने की आवश्यकता होती है।