जैसा कि हम सभी जानते हैं, प्रयोगशाला में संवर्धित कोशिकाओं के प्रकारों को मोटे तौर पर दो प्रकारों में विभाजित किया जा सकता है: अनुवर्ती कोशिकाएँ और निलंबन कोशिकाएँ, और दोनों अवस्थाओं में केवल कुछ प्रकार की कोशिकाएँ मौजूद होती हैं।
निलंबन कोशिकाएं एक प्रकार की कोशिकाओं को संदर्भित करती हैं जो एक निलंबित अवस्था में एक माध्यम में बिना किसी सहारे के विकसित हो सकती हैं, जैसे कि लिम्फोसाइट्स और अधिकांश रक्त प्रणाली-व्युत्पन्न कोशिकाएं। (जैसे माउस ल्यूकेमिया कोशिकाएं WEHI -3, मानव ल्यूकेमिया कोशिकाएं K -562, HL -60)। उद्योग में, अधिक से अधिक अनुयायी कोशिकाओं को पूर्ण निलंबन में पालतू और सुसंस्कृत किया गया है। वर्तमान में, SP2 / 0, NS 0, CHO, BHK और HEK293 सेल मुख्य रूप से उद्योग में उपयोग किए जाते हैं, और वे मुख्य रूप से पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन के लिए उपयोग किए जाते हैं; आमतौर पर पशु चिकित्सा जैविक उत्पादों में उपयोग की जाने वाली मार्ग कोशिकाओं में मुख्य रूप से पूर्ण निलंबन, एमडीसीके कोशिकाओं में संवर्धित बीएचके21 कोशिकाएं शामिल हैं; और वेरो सेल, पीके सेल, एसटी सेल, मार्क 145 सेल आदि। माइक्रोकैरियर सस्पेंशन कल्चर की मदद से प्रत्येक सेल की अलग-अलग विशेषताएं होती हैं।
सस्पेंशन सेल
सस्पेंशन सेल "टीएचपी -1" 200x
सामान्य तौर पर, निलंबन कोशिकाओं को अनुवर्ती कोशिकाओं की तुलना में संभालना आसान होता है क्योंकि निलंबन कोशिकाओं के पारित होने के लिए ट्रिप्सिनाइजेशन की आवश्यकता नहीं होती है। लेकिन इसका मतलब यह नहीं है कि अनुवर्ती कोशिकाओं की तुलना में निलंबन कोशिकाओं को विकसित करना आसान है। नौसिखियों के लिए, यह अधिक चुनौतीपूर्ण है। हमेशा विभिन्न समस्याएं होती हैं: उदाहरण के लिए, मृत कोशिकाएं और कोशिका विभेदन हमेशा क्यों दिखाई देते हैं; यह माना जाता है कि मार्ग आसान है, लेकिन परिणाम भेदभाव होगा; क्रायोप्रेज़र्वेशन और रिकवरी के बाद फिर से समस्याएँ दिखाई देती हैं!
अगला, आइए निलंबन कोशिकाओं के संवर्धन के बारे में कुछ प्रमुख बिंदुओं पर चर्चा करें ~
बिंदु 1: पर्याप्त धैर्य, यह बहुत आवश्यक है
कई निलंबन कोशिकाओं में अपेक्षाकृत कम व्यवहार्यता होती है, जब वे क्रायोप्रिजर्वेशन से ठीक हो जाते हैं। इस समय, हमें कोशिकाओं की अपनी स्वयं की मरम्मत पूरी करने और लॉगरिदमिक विकास चरण में प्रवेश करने के लिए प्रतीक्षा करने के लिए पर्याप्त धैर्य रखने की आवश्यकता है। उदाहरण के लिए, टीएचपी -1 (ह्यूमन मोनोसाइटिक ल्यूकेमिया) को अक्सर विगलन से सामान्य प्रसार तक रिकवरी अवधि के 7-10 दिनों की आवश्यकता होती है; जर्कट, क्लोन ई 6-1 (मानव टी लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं) को भी ठीक होने के 5-7 दिनों की आवश्यकता होती है। ठंड से पहले राज्य में लौट आएं। नौसिखिए इस अवधि के दौरान प्रशिक्षण छोड़ सकते हैं, इसलिए कृपया अधिक धैर्य रखें! ऐसी कोशिकाओं की खेती करना भी धैर्य पैदा करने की एक प्रक्रिया है!
बिंदु 2: टीका घनत्व को समझें
सामान्यतया, निलंबन कोशिकाओं का घनत्व 500, 000/एमएल से कम नहीं होना चाहिए। कई निलंबन कोशिकाएं घनत्व-निर्भर हैं, और कम घनत्व के कारण अप्रसार भी नौसिखियों के लिए आम समस्याओं में से एक है। बेशक, बहुत कम कोशिकाएं हैं जिनकी घनत्व अधिक होने पर स्थिति खराब हो जाती है, जैसे W6/32 (माउस बी सेल हाइब्रिडोमा सेल)। इसलिए, अज्ञात कोशिकाओं की खेती करने से पहले कोशिकाओं की विशेषताओं को समझने के लिए प्रासंगिक जानकारी की खोज करना बहुत महत्वपूर्ण है। केवल स्वयं को और शत्रु को जानकर ही आप सभी युद्ध जीत सकते हैं!
मध्यम प्रतिस्थापन की आवृत्ति "स्पष्ट रूप से" तक सीमित नहीं होनी चाहिए। कोशिकाएं जीवित चीजें हैं। एक सतत संवर्धन चक्र के दौरान, कोशिकाओं की अच्छी वृद्धि की स्थिति बनाए रखने के लिए कोशिकाओं की वृद्धि की स्थिति के आधार पर पूरक माध्यम और ग्लूकोज जैसे विशिष्ट पोषक तत्वों को कई बार जोड़ा जा सकता है। . निलंबन संस्कृति प्रक्रिया के दौरान, कोशिकाओं के प्रसार के साथ, मूल माध्यम में पोषक तत्वों की खपत और मेटाबोलाइट्स में वृद्धि, कोशिकाओं की व्यवहार्यता कम हो जाएगी, और पोषक तत्वों का समय पर पूरक कोशिकाओं को अपेक्षाकृत अच्छे जीवित वातावरण में बना देगा। मैं यहां विवरण में नहीं जाऊंगा, और बार-बार सेंट्रीफ्यूगेशन और तरल प्रतिस्थापन से बचूंगा।
चलो तरल प्रतिस्थापन विधि के बारे में बात करते हैं:
①केन्द्रापसारक पूर्ण तरल विनिमय विधि
यानी, सेंट्रीफ्यूगेशन (800-1000rpm, 5min) द्वारा सभी पुराने माध्यम को हटा दें, और नए माध्यम से बदल दें। यह विधि "त्वचा ठोस" अच्छी तरह से उठाए गए निलंबन कोशिकाओं (जैसे के 562) के मध्यम प्रतिस्थापन के लिए उपयुक्त है, या वर्तमान स्थिति जहां कोशिकाएं अच्छी स्थिति में हैं और घनत्व उच्च है, जिसके परिणामस्वरूप माध्यम की बड़ी खपत होती है। इस पद्धति का लाभ यह है कि माध्यम को पूरी तरह से बदल दिया जाता है और कुछ सेल मलबे को हटाया जा सकता है, लेकिन इससे कोशिकाओं को कुछ हद तक यांत्रिक क्षति भी होगी।
②केन्द्रापसारक आधा विनिमय विधि
यानी, (800-1000rpm, 5min) 50 प्रतिशत सेल सस्पेंशन को अपकेन्द्रित करके, ताज़ा माध्यम के 50 प्रतिशत आयतन को बदलें। यह विधि "पाखंडी" मुश्किल-से-संस्कृति कोशिकाओं (जैसे टीएचपी -1) की तुलना करने के लिए उपयुक्त है, या ऐसी स्थिति जहां घनत्व कम है लेकिन समायोजन स्थिति में अधिक मलबे को हटाने की जरूरत है।
③ अवसादन तरल विनिमय विधि
अर्थात्, एक अपकेंद्रित्र का उपयोग करने के बजाय, गुरुत्वाकर्षण द्वारा प्राकृतिक अवसादन की विधि का उपयोग माध्यम को कोशिकाओं से अलग करने के लिए किया जाता है, ताकि ताजा माध्यम के सभी या हिस्से को बदल दिया जा सके। हालाँकि, इसकी अनुप्रयोग सीमाएँ हैं - यह केवल उन कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है जो एक निश्चित आकार के सेल क्लस्टर बना सकते हैं (अन्यथा वे स्वाभाविक रूप से व्यवस्थित नहीं हो सकते हैं और केवल कम गति पर सेंट्रीफ्यूज हो सकते हैं), विशेष रूप से उन कोशिकाओं के साथ काम करते समय जो प्रसार के लिए सेल एकत्रीकरण पर भरोसा करते हैं। , जैसे एनके-92, एनके- 92 एमआई, जर्कट। यह विधि तरल विनिमय प्रक्रिया के दौरान सेंट्रीफ्यूगेशन प्रक्रिया के कारण होने वाली यांत्रिक क्षति को कम कर सकती है, जबकि एकत्रित सेल द्रव्यमान को बनाए रखते हुए, और सेल मलबे को हटाना अपेक्षाकृत पूरी तरह से है।
उपरोक्त बिंदुओं में महारत हासिल करने के बाद, एक अच्छा सेल बीज, यह "सुंदर" निलंबन कोशिकाओं को विकसित करने के लिए कोने के आसपास है!
सेल कल्चर प्लेट
योंग्यू मेडिकल की यू-आकार की सेल कल्चर प्लेट का उपयोग चिकित्सा ग्रेड पॉलीस्टायरीन (पीएस) का उपयोग करके निलंबन कोशिकाओं को संवर्धित करने के लिए किया जाता है, जो 100, 000-स्तर शुद्धिकरण कार्यशाला में उत्पादित, विकिरण द्वारा निष्फल, DNase, RNase, और पाइरोजेन से मुक्त होता है। -मुक्त, सुरक्षा और पर्यावरण संरक्षण।
सेल संस्कृति प्लेटें विभिन्न जीवाणु संस्कृतियों की जरूरतों को पूरा करने के लिए विभिन्न विशिष्टताओं में उपलब्ध हैं। उत्पाद प्रकारों को 6-वेल, 12-वेल, 24-वेल, 48-वेल, 96-वेल, और 384-वेल, में विभाजित किया गया है जो 96-वेल फ्लैट-बॉटम, यू-बॉटम, वी-बॉटम बॉटम में बांटा गया है; यू-आकार की संस्कृति प्लेटें ज्यादातर निलंबन कोशिकाओं के संवर्धन के लिए उपयोग की जाती हैं; वी-आकार की कल्चर प्लेटें ज्यादातर इम्यूनोलॉजिकल हेमग्लुटिनेशन प्रयोगों के लिए उपयोग की जाती हैं।