सेल क्लाइम्बिंग स्लाइड्स पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस के डबल-लेबलिंग प्रयोग की संचालन प्रक्रिया

1. कल्चरल प्लेट में, हर बार 3 मिनट के लिए तीन बार पीबीएस के साथ चढ़ाई गई स्लाइड्स को भिगो दें।

2. 15 मिनट के लिए 4 प्रतिशत पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ स्लाइड्स को ठीक करें, और स्लाइड्स को पीबीएस में 3 बार, 3 मिनट हर बार सोखें।

3. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 0.5 प्रतिशत ट्राइटन एक्स -100 (पीबीएस में तैयार) के साथ पारगम्य (कोशिका झिल्ली पर व्यक्त एंटीजन के लिए, यह चरण छोड़ा गया है)।

4. सीरम अवरुद्ध: प्रत्येक बार 3 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड्स को 3 बार विसर्जित करें, शोषक पेपर के साथ पीबीएस को सुखाएं, स्लाइड्स पर सामान्य बकरी सीरम (बशर्ते कि माध्यमिक एंटीबॉडी स्रोत बकरी हो) जोड़ें, और कमरे के तापमान पर ब्लॉक करें। 30 मिनट।

5. प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें: शोषक कागज के साथ अवरुद्ध समाधान को अवशोषित करें, धोएं नहीं, प्रत्येक स्लाइड में पर्याप्त मात्रा में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और इसे गीले बॉक्स में डालें, रात भर 4 डिग्री पर सेते रहें।

6. फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें: पीबीएसटी में स्लाइड्स को 3 बार, 3 मिनट के लिए विसर्जित करें, शोषक कागज के साथ स्लाइड्स पर अतिरिक्त तरल को अवशोषित करें, पतला फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी ड्रॉपवाइज जोड़ें, 1 घंटे के लिए 20-37 डिग्री पर इनक्यूबेट करें एक गीले बॉक्स में, पीबीएसटी स्लाइस में 3 बार भिगोएँ, हर बार 3 मिनट।

नोट: फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी के अलावा, बाद के सभी चरणों को यथासंभव एक अंधेरी जगह में किया जाना चाहिए।

7. सीरम ब्लॉकिंग: लिक्विड को अब्सॉर्बेंट पेपर से ब्लॉट करें, सामान्य बकरी सीरम को ग्लास स्लाइड पर डालें (बशर्ते कि सेकेंडरी एंटीबॉडी स्रोत बकरी हो), और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ब्लॉक कर दें।

8. प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें: शोषक कागज के साथ अवरुद्ध समाधान को अवशोषित करें, धोएं नहीं, फिर पतला प्राथमिक एंटीबॉडी ड्रॉपवाइज जोड़ें, और प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने के बाद अंधेरे में 4 डिग्री आर्द्र बॉक्स में रात भर सेते रहें। (ध्यान दें: दूसरी प्राथमिक एंटीबॉडी की प्रजातियां पहले प्राथमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों से भिन्न होती हैं, जैसे माउस और खरगोश)

9. फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें: पीबीएसटी में स्लाइड्स को 3 बार, 3 मिनट के लिए विसर्जित करें, शोषक कागज के साथ स्लाइड्स पर अतिरिक्त तरल को अवशोषित करें, पतला फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी ड्रॉपवाइज जोड़ें, 1 घंटे के लिए 20-37 डिग्री पर इनक्यूबेट करें एक गीले बॉक्स में, पीबीएसटी स्लाइस में 3 बार भिगोएँ, हर बार 3 मिनट। (नोट: यदि पहले एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए लाल प्रतिदीप्ति का चयन किया जाता है, तो दूसरे को प्रतिदीप्ति के अन्य रंगों का चयन करना होगा)

10. काउंटरस्टेनिंग नाभिक: डीएपीआई को ड्रॉपवाइज जोड़ा गया और 5 मिनट के लिए अंधेरे में डाला गया, नमूनों को दाग दिया गया, और अतिरिक्त डीएपीआई को पीबीएसटी 5min × 4 बार धोया गया।

11. शोषक कागज के साथ स्लाइड पर तरल को सुखाएं, स्लाइड को एंटी-फ्लोरेसेंस क्वेंचर युक्त बढ़ते तरल के साथ सील करें, और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत छवियों का निरीक्षण करें और एकत्र करें।